Tahap proses PCR
Sebelumnya Kita telah membahas tentang lima komponen pendukung PCR dalam ulasan yang berjudul “POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)”, sekarang mari melanjutkan ke tahap proses PCR.
Lima komponen pendukung PCR tentu sangat dibutuhkan dalam mengoperasikan sistem yang menakjubkan ini. Mengapa dikatakan menakjubkan? Karena dengan adanya PCR membuat berbagai bidang kesehatan, penelitian dan lain sebagainya menjadi berkembang pesat.
Nah, untuk mengoperasikan alat ini, setidaknya ada tiga tahapan yang Anda perlu dan harus perhatikan dengan seksama yaitu pre-PCR seperti preparasi reagensia dan spesimen, proses amplifikasi dan terakhir post-PCR dengan hasil akhir berupa deteksi atau analisa hasil.
Baca : Mengukur Konsentrasi DNA
Sekarang, mari bahas proses amplifikasi, dimana dalam reaksi ini dimulai dari proses denaturasi (pemisahan) rantai DNA template, penempelan primer (annealing) pada DNA target dan pemanjangan (extension) primer atau reaksi polimerisasi yang dikatalisis oleh DNA Polimerase. Masing-masing tahap proses PCR membutuhkan kisaran suhu 95°C, 50°C dan 72°C.
Gambar: GENESIG q16 Real Time PCR Machine
1. Pemisahan (Denaturasi) DNA Template
Denaturasi adalah perubahan atau modifikasi struktur sekuender, tersier dan kuartener molekul tanpa adanya pemecahan ikatan peptida. Denaturasi DNA tamplate adalah proses terputusnya ikatan hidrogen antar basa yang terdapat dalam pasangan untai DNA tamplate. Untai ganda DNA template (unamplified DNA) dipisahkan dengan denaturasi termal (suhu 95°C). Proses ini menyebabkan DNA yang semula untai ganda, kini terpecah menjadi untai tunggal. Sampai di sini, proses berlanjut pada tahapan berikutnya yaitu penempelan primer.
2. Penempelan (Annealing) Primer
Tahapan ini merupakan tahap lanjutan dari terputusnya ikatan ganda DNA tamplate menjadi untai tunggal. Masing-masing untai tunggal DNA template akan mengalami proses ‘pendinginan’ hingga mencapai suhu tertentu. Hal ini dimaksudkan untuk memberi jeda bagi penempelan primer. Setiap untai tunggal DNA template akan ditempeli pasangan primer. Di alam, primer dibuat oleh enzim yang disebut primase. Ada dua jenis primer yang akan menempel, yaitu primer maju (forward primer) dan primer mundur (reserve primer).
Setiap pasangan primer tersebut telah dipilih sedemikian rupa agar satu primer bersifat komplementer terhadap salah satu ujung gen yang diinginkan pada salah satu rantai. Jadi, masing-masing primer akan menempati ujung yang berbeda pada untai DNA. Pasangan primer ini akan membentuk ikatan hidrogen dengan sekuen komplementernya. Dengan demikian maka akan terbentuk molekul untai ganda yang stabil.
Baca : Sekuensing DNA
3. Pemanjangan (Extension) Primer
DNA Polimerase digunakan untuk proses memperpanjang primer (extend primers) dengan adanya bantuan dari dNTPs (dATP, dCTP, dGTP dan dTTP) dan buffer yang sesuai. DNA Polimerase yang paling sering digunakan dalam PCR berasal dari strain bakteri Thermus aquaticus yang hidup di sumber air panas Yellowstone National Park. Bakteri ini dapat bertahan hidup pada suhu medekati titik didih dan bekerja optimal pada 72 °C (162 ° F). Primer yang telah menempel pada untai tunggal DNA template akan mengalami perpanjangan pada sisi 3’ dengan penambahan dNTP yang komplemen dengan template DNA polimerase. Proses pemanjangan (extension) primer ini juga dikenal dengan istilah polimerisasi primer.
Baca Juga :
Ini Dia ‘Kenakalan’ Masa Kecil Yang Ternyata Bagus untuk Otak
Waspada, Ini 4 Makanan Penurun Daya Ingat
‘Protein Urin’ untuk Identifikasi Kanker Pankreas
