Teknik Asam nukleat adalah pelajaran favorit saya waktu saya kuliah. Namun ada hal yang membuat saya tidak nyaman dalam mengukur konsentrasi DNA. Dalam metode lama, kita harus mengencerkan DNA telah diperoleh dari ekstraksi ke dalam volume yang lebih besar. Alasan kita harus melakukannya adalah volume DNA kita dapatkan dari ekstraksi sangat kurang dari volume yang diperlukan untuk kuvet dalam spektrofotometer UV konvensional.
Biasanya kita mengencerkan DNA menjadi 40-50 kali lipat lebih encer. Setelah itu kita mengukur absorbansi DNA yang sudah diencerkan dalam beberapa panjang gelombang UV seperti 230, 260 dan 280 nm. Kita juga mengukur absorbansi blangko untuk koreksi / normalisasi. Dengan koefisien khusus untuk untai ganda asam nukleat (DNA) 50 ug/ml, berkorelasi dengan 1 absorbansi, kita siap untuk menghitung konsentrasi DNA.
Berdasarkan Hukum Lambert-Beer, A = ε. d. c, di mana “A” adalah absorbansi, koefisien zat “ε”, dan “d” adalah panjang jalan tempuh sinar dalam kuvet di spektrofotometer dan “c” adalah konsentrasi. Semua data yang diperoleh dikurangi oleh absorbansi blangko, maka absorbansi bersih dari pengukuran di panjang gelombang 260 nm dikalikan terhadap 50 ug/ml.
Kita belum tahu konsentrasi DNA belum sebelum menempatkan faktor pengenceran ke dalam perhitungan. Setelah faktor pengenceran dihitung, akhirnya kita mendapatkan konsentrasi DNA. Tahapan pengukuran konsentrasi DNA menggunakan metode lama ini dari mengurangi volume sampel kita, kita juga tidak diperbolehkan untuk melupakan label apa kuvet berisi sampel apa.
Catatan faktor pengenceran harus tetap aman karena sangat penting untuk hasil akhir. Cara ini berarti banyak pipetting, memakai habis tips mikropipet, juga membutuhkan banyak tabung microvolume. Satu hal yang penting juga dikonsumsi adalah waktu dan tenaga.
Setelah konsentrasi DNA yang diperoleh, kita perlu menghitung beberapa parameter kemurnian, pertama 260/230 nm sebagai kemurnian DNA/Asam nukleat terhadap Phenol dan 260/280 nm sebagai kemurnian DNA/Asam nukleat terhadap Protein. Kualitas DNA yang baik memiliki nilai 260/230 pada 1,8 dan 260/280 nm pada 2,0. Itu adalah kondisi ideal.
Mengenai jumlah pengukuran DNA atau kuantifikasi atas, dapat Anda lihat itu membawa kita terlalu banyak sumber daya dan energi, dapat Anda bayangkan jika sampel Anda cukup banyak, katakanlah 50 sampel/hari, mengukur konsentrasi DNA dengan cara lama dapat mengambil setengah hari Anda. Protokol yang sama juga dapat diterapkan untuk RNA.
Untunglah ada orang-orang kreatif di dunia ini menangkap rasa sakit yang diderita oleh peneliti dalam mengukur DNA/asam nukleat
Sebenarnya bukan “baru” karena metode ini ditemukan pada tahun 2000. Setidaknya berdirinya metode ini menetapkan era baru kuantifikasi asam nukleat. Jika saya diringkas dari masalah yang disebabkan oleh cara lama asam nukleat kuantifikasi, ada dua masalah besar, pertama perlu volume yang relatif besar sampel agar sesuai volume kuvet, sementara sampel bisa sangat langka untuk didapatkan. Masalah kedua adalah pengenceran. Pengenceran itu melelahkan. Ketiga adalah membersihkan cuvette adalah memakan waktu. Keempat adalah perhitungan dapat menjadi rumit dan rawan kesalahan.
Dalam mikro spektrofotometri Volume UV, yang harus kita lakukan adalah meletakkan sampel volume mikro (1-2 mikroliter) ke tempat yang disebut “pedestal”. Karena alas ini terbuat dari stainless steel hidrofobik, cairan akan membentuk bulat “bola”. Langkah selanjutnya adalah menarik ke bawah disebut “lengan”. Lengan akan terhubung dengan alas melalui cairan Volume mikro membentuk kolom. Cahaya akan disinarkan dari atas lengan melalui kolom cairan ini. Jarak maksimum adalah 1 milimeter.
Absorbansi dapat dihitung dari cahaya yang ditransmisikan dan cahaya yang terdeteksi dalam beberapa detik. Semua parameter standar (konsentrasi nukleat, rasio kemurnian) secara otomatis dihitung menggunakan software juga dalam beberapa detik. Perangkat lunak ini juga menunjukkan grafik pengukuran berbagai absorbansi dari panjang gelombang 190-340 nm. Dengan metode ini, semua masalah dalam metode lama diselesaikan, dan bahkan lebih, karakteristik asam nukleat dimurnikan baik dapat diketahui dari grafik.
Perpindahan dari satu sampel ke yang lain, yang harus kita lakukan hanyalah menghapus alas menggunakan kertas tisu laboratorium yang sesuai. Hal ini sangat sederhana dan tidak memakan waktu. Jika Anda peduli dengan kontaminasi sampel, itu terjadi namunsecara statistik tidak signifikan. Hanya memberikan ddH2O tambahan antara pengukuran sampel untuk membuat Anda merasa nyaman, bahkan tidak wajib dan hanya akan memperlambat kerja Anda.
Semuanya itu dilakukan hanya 3-5 detik! Hanya dengan menempatkan sampel Anda dalam volume yang sangat rendah (1-2 mikroliter) ke alas, tarik ke bawah lengan alas dan satu kali klik pada tombol ukuran memberikan semua data yang Anda butuhkan dalam kuantifikasi dalam waktu 5 detik.
Melakukan pengukuran untuk blangko adalah wajib karena ini adalah tetap spektrofotometri yang sama. Sebelum kita memberikan blangko, tombol perintah ukur tidak akan muncul. Blangko adalah zat yang sama kecuali tidak mengandung zat dari sampel. Artinya blangko adalah pelarut asam nukleat. Berikan buffer yang relevan akan ok.
Mikro Volume UV spektrofotometri sangat berguna karena kondisi yang sangat menuntut situasi penelitian saat ini seperti jumlah sampel yang banyak di mana metode lama akan menyiksa peneliti. Tentu saja beberapa harga harus dibebankan untuk teknologi tersebut; harga instrumen dapat dua atau ketiga kalinya spektrofotometer biasa. Namun, saya yakin itu akan sepadan karena tidak perlu mengeluarkan biaya apapun (misalnya bahan habis pakai) ketika menjalankan instrumen.
Saya memiliki pengalaman. Pada saat itu, tampaknya ekstraksi asam nukleat telah gagal tanpa kabut putih sama sekali terlihat pada tabung akhir. Untungnya saya membawa instrumen ini, dan kemudian saya mengambil sedikit sampel untuk mencari tahu. Hasilnya diketahui bahwa ada 5 nanogram DNA yang sebenarnya masih mungkin untuk melakukan Polymerase Chain Reaction (PCR), jadi, ekstraksi asam nukleat tidak gagal.
Saya juga tahu bahwa salah satu lembaga nasional di Indonesia menggunakan real time PCR untuk mengukur asam nukleat. Itu menggunakan volume mikro yang sama sampel tetapi tidak menghitung waktu dan biaya reagen. Dapatkah Anda bayangkan berapa lama waktu yang dibutuhkan untuk teknik PCR ini real time? Ini akan memakan waktu sekitar 1,5 jam proses. Hal ini menjadi 5400 detik proses terhadap proses 5 detik. Belum lagi biaya reagen yang dibutuhkan yang akan biaya sekitar USD 40 per sampel sementara volume yang mikro UV spektrofotometri tidak dikenakan biaya sama sekali.
Mikro Volume UV spektrofotometri digunakan dalam biologi molekuler baru-baru ini teknik seperti microarray dan DNA sequencing. Konsentrasi dan kemurnian asam nukleat sebagai masukan dalam teknik tertentu menjadi penting untuk mendapatkan hasil yang dapat diandalkan.
Saya masih ingat menghadiri kelas ketika saya di perguruan tinggi; dosen kuliah Lambert Hukum Beer. Itu luar biasa bagi saya untuk mengetahui bahwa kuliah berguna bagi saya =)
