Polymerase Chain Reaction
Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah teknik sintesis dan amplifikasi DNA secara in vitro yang digunakan untuk menyalin segmen DNA hingga jutaan kali dalam waktu yang cukup singkat. Pertama kali dikembangkan pada 1985 oleh Karry Mullis.
Penemuan teknik PCR beserta teknik lain seperti sekuensing DNA, menjadi titik fundamental dalam bidang sains dan teknologi. Terlebih dalam bidang diagnosis penyakit, identifikasi virus dan bakteri, evolusi molekular, kedokteran forensik dan masih banyak lainnya.
Sumber gambar: LabSatu (GENESIG q16 Real Time PCR Machine)
Lima Komponen PCR
Seperti halnya mengoperasikan berbagai alat yang membutuhkan entah perangkat maupun bahan tertentu agar dapat bekerja dengan baik. Maka, seperti itu pula dalam mengoperasikan PCR diperlukan lima komponen pendukung agar produk yang dihasilkan baik dan benar. Adapun komponen yang diperlukan dalam proses PCR adalah:
1. DNA Template
Dalam melakukan sebuah penelitian pasti mempunyai target, nah template DNA merupakan DNA target yang nantinya akan diamplifikasi menggunakan PCR. DNA tamplate adalah DNA untai ganda yang terdiri dari urutan fragmen basa atau gen yang akan digandakan. Urutan fragmen basa inilah yang nantinya akan diamplifikasi atau dikenal juga dengan istilah target sequence (urutan target).
Banyak atau sedikitnya DNA target tidak terlalu berpengaruh terhadap hasil kualitas PCR karena pada dasarnya penggandaan urutan target merupakan akumulasi polimerasi molekul primer. Jika Anda menggunakan DNA genom, ada baiknya dipotong dahulu, misalnya dengan enzim NotI atau Sa1I agar potongan yang dihasilkan cukup besar.
2. Primer
Seperti telah disebutkan sebelumnya bahwa penggandaan urutan DNA target merupakan akumulasi polimerasi molekul primer, maka pasangan primer berperan besar dalam aplikasi PCR. Pada dasarnya, proses polimerisasi primer berlangsung karena adanya tambahan basa demi basa dari dNTP.
Pasangan primer oligonukleotida sintetik berguna untuk mengapit atau pembatas urutan/fragmen DNA target yang akan diamplifikasi. Selain itu, primer berfungsi sebagai penyedia gugus hidroksi pada ujung 3’ yang diperlukan dalam proses eksistensi DNA dan merupakan komponen PCR yang nantinya akan menempel pada ssDNA saat proses annealing. Pasangan primer terdiri dari primer maju (forward primer) dan primer mundur (reverse primer).
Primer merupakan molekul oligonukleotida untai tunggal yang terdiri dari sekitar 18 sampai 30 basa. Namun apabila PCR digunakan dalam analisis RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA), maka ukuran primer tidak boleh lebih dari 10 basa nukleotida. Panjang primer yang tidak sesuai atau konsentrasi primer yang tinggi akan menyebabkan terjadinya mispriming atau menyebabkan penempelan pada sekuen DNA yang salah.
3. Deoxynucleoside triphosphates (dNTPs)
Material utama yang dibutuhkan untuk sintesis DNA dalam proses PCR adalah Deoxynucleoside triphosphates (dNTPs) yang terdiri dari dATP, dGTP, dCTP dan dTTP. Anda hanya butuh dNTPs dalam konsentrasi 200 µM. dNTP merupakan suatu blok tempat dimana DNA polimerase mensintesis untai DNA baru.
4. Enzim DNA Polimerase
Sumber gambar: LabSatu (BIONEER AccuPower HotStart PCR PreMix)
Baca : 5 Tips Cara Menggunakan Biosafety Cabinet
Fungsi dari enzim DNA polimerase adalah bekerjasama dengan dNTP agar dapat melakukan proses polimerisasi primer. Namun enzim DNA polimerase yang digunkan dalam proses PCR harus dalam kondisi termostabil. Hal ini berkaitan dengan salah satu tahap reaksi yang ada pada PCR yaitu saat denaturasi untai ganda DNA yang membutuhkan suhu sangat tinggi (± 95°C). Anda bisa menggunakan Taq DNA polimerase, yang berasal dari bakteri termofilik Thermus aquaticus.
5. Larutan penyangga (buffer)
Salah satu fungsi dari larutan buffer dalam proses PCR adalah menyediakan lingkungan yang cocok untuk aktivitas optimum dan stabilitas DNA polimerase. Buffer ini mengandung ion Mg2+ yang sangat mempengaruhi setiap tahapan reaksi PCR.
Infografis:
Baca Juga :
